A composição da parede celular das bactérias gram-positivas determina a fixação do corante cristal violeta/lugol, que não é removido pela ação do álcool/acetona.

A morfologia das culturas bacterianas determina a coloração diferencial, em que os cocos são gram-positivas e os bacilos são gram-negativas.

O uso do contracorante, após a lavagem com etanol, determina a coloração vermelha das bactérias gram-positivas.

A coloração diferencial é determinada pela ação conjunta do corante e contra-corante nas estruturas celulares internas, resultando em coloração roxa para bactérias gram-positivas e vermelha para gram-negativas.

A membrana citoplasmática define a cor roxa ou vermelha da célula bacteriana.