Requer a otimização de um importante parâmetro que é a temperatura de desnaturação.

Não permite, por meio do uso do Sybergreen®, verificar a curva de dissociação, mesmo em termocicladores modernos.

Depende do uso de fluorescência, que é medida ao final da reação, tal como o produto de PCR comum é corrido em gel de agarose, geralmente visualizado em luz UV.

Não pode ser aplicada na detecção de mutações, apesar de sua alta sensibilidade.

Tem como parâmetro importante o Ct (cycle threshold), que indica o ciclo da reação no qual a amplificação começa a ser detectada a níveis superiores ao ruído (background) e passa a acontecer de forma exponencial.