Meios de rotina como ágar sangue e ágar McConkey permitem o isolamento de todos os microrganismos associados à mastite bovina, e, por isso, são os mais utilizados para isolamento bacteriano, seguido das provas bioquímicas para identificação do agente.

Microrganismos envolvidos na mastite contagiosa, como as enterobactérias, tendem a serem corados pela fucsina (vermelho ou rosa) na coloração de Gram. Microrganismos envolvidos nas mastites ambientais, como o Streptococcus agalactiae e Staphylococcus aureus são considerados gram-negativos.

Para o isolamento bacteriano, deve-se lavar os tetos e secá-los. Depois, aplicar na extremidade de cada teto uma solução com álcool etílico 70%. Descartar o primeiro jato e colher o leite do animal suspeito em um frasco estéril, que deverá ser mantido refrigerado até enviar para o laboratório.

Para realização do teste de sensibilidade aos anti-microbianos (antibiograma), os isolados bacterianos devem ser semeados em meio ágar-sangue ou ágar McConkey, onde serão colocados discos impregnados com os princípios ativos. Após oito horas de incubação, é possível mensurar o halo de inibição para avaliar a sensibilidade do agente microbiano aos antibióticos.