O método de Sanger revolucionou o sequenciamento de DNA pela não utilização de substâncias radioativas marcando os ddNTPs, e ficou conhecido como sequenciamento da segunda geração.

Após o término da reação de sequenciamento, ela é submetida à eletroforese capilar. Todos os fragmentos recém-sintetizados, cada um terminado em um nucleotídeo diferente e cada um marcado com um diferente fluoróforo, são separados pelas respectivas cores.

Após a etapa de desnaturação do DNA, é colocado um primer na extremidade 5¿ de uma das cadeias e, com a ajuda de uma DNA polimerase, sintetiza-se a cadeia complementar por completo.

Os métodos de sequenciamento têm base na produção de fragmentos de DNA de comprimento crescente, que começam em um ponto comum e possuem todos os quatro tipos de nucleotídeos nas respectivas extremidades.

Os nucleotídeos empregados nessa técnica são quimicamente modificados de forma que não apresentam um terminal hidroxila (3´-OH), impedindo a inserção de um novo nucleotídeo pela DNA polimerase.